Disulfiram联合Cu对Raji细胞及其裸鼠移植瘤生长的影响及分子机制的研究

背景:
　　 Burkitt's淋巴瘤是一种侵袭性B细胞非霍奇金淋巴瘤，疾病进展快，死亡率高。虽然随着化疗及免疫治疗等研究的进展，Burkitt's淋巴瘤患者的治疗效果已有明显改善，但复发及大剂量化疗的毒副作用仍是影响淋巴瘤肿瘤疗效进一步提高的主要障碍;而新的分子靶向治疗药物也存在价格昂贵和耐药问题，从价廉且毒副作用小的传统药物中开发具有抗淋巴瘤活性的“新用途”越来越引起重视。
　　 Disulfiram(DS)是一种能够抑制醇脱氢酶的二硫代氨基甲酸盐药物，已经在临床上广泛应用于抗酗酒，安全低毒且价格低廉。已有研究报道DS还具有抗肿瘤效应，它对乳腺癌、结肠癌等多种实体肿瘤细胞均具有抑制增殖和诱导凋亡的作用，另外，我们过去的研究也证实DS对白血病细胞具有抗肿瘤作用。DS作为一种二价金属离子螯合物，能够与Cu离子螯合形成DS/Cu复合物，DS/Cu能显著提高DS诱导肿瘤细胞凋亡作用。但有关DS及DS联合Cu对淋巴瘤细胞增殖和凋亡的影响及分子机制尚不明确，因此需进一步探索其作用及分子机制。
　　 有关DS抗肿瘤作用机制的研究近年取得了不少新进展，尤其在促凋亡机制方面，发现与多条信号传导通路有关。活性氧(ROS)包括过氧化氢(H2O2)、超氧阴离子(O2-)、羟自由基(OH-)及脂质过氧化物等，ROS不仅可作为一种毒性物质介导炎性损伤，近年发现它还是信息家族分子中的重要成员之一，对细胞具有广泛的调节功能，在细胞凋亡中具有重要意义。ROS是细胞凋亡的早期信号，它可作用于线粒体，促使线粒体膜通透性改变、细胞色素C释放，还能与caspase9前体、ATP/dATP形成凋亡体，然后激活caspase3、caspase9，进而诱发caspase级联反应，使DNA断裂，引起细胞凋亡，而损伤的线粒体能产生更多活性氧，进一步引起细胞凋亡。研究表明肿瘤细胞ROS水平略高于正常细胞，但由于有效的抗氧化机制的存在，肿瘤细胞对相对高水平的ROS是可以耐受。但在刺激信号作用下ROS进一步升高，可触发线粒体跨膜电势降低，使线粒体释放细胞色素C而诱导细胞凋亡。
　　 C-Jun氨基末端激酶(JNK)是MAPK重要成员之一，JNK也是实现细胞凋亡激活的通路之一，活化的JNK能诱导细胞凋亡，特别是各种应激导致的细胞凋亡。C-jun蛋白是JNK的作用底物，在外界作用刺激下，JNK表达上调或磷酸化水平上调将通过诱导C-Jun蛋白的氨基末端发生磷酸化，作为凋亡信号传递到细胞核内部，诱导细胞凋亡发生。在众多的外界应激因素中活性氧是非常常见的一种，近来研究发现ROS的大量产生使得JNK持续激活，最终导致细胞由生存走向死亡。因此JNK介导的信号转导途径及活性氧在这一途径中的作用可能是DS诱导淋巴瘤细胞凋亡的一个重要分子机制。
　　 在多种肿瘤细胞中，NF-κB是活化的，NF-κB能够调控许多对肿瘤细胞存活、分化和凋亡非常重要的基因的表达。通常所指的NF-κB为P50/P65异源二聚体，调控下游一系列抗凋亡基因的表达。抑制P65的活性可抑制由NF-κB所启动的基因转录，使细胞的生长受到抑制，最终诱导细胞发生凋亡。已有研究发现DS/Cu可普遍抑制NF-κB的表达水平，从而诱导乳腺癌细胞凋亡。另外，有研究报道ROS可抑制NF-κB的激活。因此，ROS抑制NF-κB的活化可能增强JNK活化的促凋亡作用。
　　 Nrf2是细胞调节抗氧化应激反应的重要转录因子，生理状态下Nrf2与胞质蛋白伴侣分子keap1结合使活性处于相对抑制状态，氧化应激作用下导致Nrf2与Keap1解耦联，活化Nrf2转移入核内，调控其下游第Ⅱ相解毒酶、抗氧化酶及某些药物转运泵等靶基因的表达，保护基因免受损伤，与肿瘤耐药密切相关。而研究发现高水平的ROS可破坏具有抗氧化作用的转录因子Nrf2活性，因而进一步增强ROS介导的细胞凋亡。促进ROS生成及抑制Nrf2活性有望成为抗肿瘤治疗的有效方法之一。
　　 本研究以Raji细胞及雌性、四周龄BALB/C裸鼠为研究对象，研究DS及DS/Cu对Raji细胞生长和凋亡的影响及其与ROS/Nrf2、JNK及NF-κB通路的关系;同时进一步观察DS及DS/Cu对Raji细胞BALB/C裸鼠移植瘤生长的影响，为将来临床应用奠定坚实的实验基础。
　　 目的:
　　 本课题以Burkitt's淋巴瘤细胞株Raji细胞和BALB/C裸鼠为研究对象，探讨DS/Cu能否在体外诱导Raji细胞凋亡并抑制其增殖，明确DS/Cu对Burkitt's淋巴瘤裸鼠移植瘤生长的影响。进一步从ROS/Nrf2、JNK、以及NF-κB通路探讨其潜在的分子机制。
　　 方法:
　　 1、细胞株:人B细胞淋巴瘤(Burkitt's)细胞株Raji。
　　 2、实验动物:雌性、4周龄BALB/C裸鼠，购自广东省动物实验中心。
　　 3、MTT法评价浓度分别为0.05、0.125、0.25、1.25、2.5μM的DS及上述浓度DS联合Cu作用72小时后对Raji细胞株的体外增殖抑制作用，明确DS和DS/Cu对Raji细胞株的IC50。
　　 4、Annexin V-FITC/PI双染色流式细胞术检测对照组、DS组(DS: IC50-Ds)、DS/Cu组（DS: IC50-Ds，Cu:1μm）分别作用Raji细胞6h、12h、24h后的凋亡细胞比例。
　　 5、流式细胞仪检测对照组、DS组(DS: IC50-Ds)、DS/Cu组(DS: IC50-DS，Cu:1μm)分别作用Raji细胞6h、12h、24h后细胞内的ROS水平。
　　 6、1) Western Blotting检测对照组、Cu组（1μm）、DS组(DS: IC50-Ds)、DS/Cu组（DS: IC50-DS，Cu:1μm）作用24小时后Raji细胞内P65、作用1小时后磷酸化JNK(P-JNK)表达水平变化，作用6小时后其下游分子C-jun蛋白表达变化。
　　 2) Western Blotting检测上述各个处理组分别作用6小时、12小时及24小时后Raji细胞核内Nrf2蛋白表达变化。
　　 3) Western Blotting检测对照组、DS组（DS:IC50-Ds）、DS/Cu组(DS: IC50-DS，Cu:1μn)、DS/Cu/NAC组(DSF:IC50-DS,Cu:1μmn,NAC:10mM)四组作用24小时后Raji细胞C-jun、Nrf2和p65蛋白表达变化。
　　 7、1)建立动物模型:24只裸鼠接种前2天每只全身给予2GyX射线照射2min，于裸鼠背部近腋下处皮下接种对数生长期Raji细胞3×107个，液体总量为0.2ml，每2天观察活动情况和体重。
　　 2)分组及药物治疗干预:将18只荷瘤裸鼠随机分为3组:空白对照组、DS单药组、DS联合Cu组，每组6只。DS组6只裸鼠分别于(+1d～+5d，+，8d～+12d)灌胃口服DS3mg/20g(液体总量200μl)，DS/Cu组6只裸鼠分别于(+1d～+5d，+，8d～+12d)灌胃口服DS3mg/20g（液体总量100μl）、Cu0.17mg/20g（液体总量100μl），对照组灌胃口服同样剂量的生理盐水。
　　 3)疗效评价:从首次给药前起每2天用游标卡尺测量肿瘤的最大垂直径，根据长×宽2×0.5计算肿瘤体积(Tumor Volume，TV)，比较各组治疗后肿瘤体积。连续给药结束后24小时，颈椎脱臼法处死裸鼠，将移植留完整切除，并称其重量，比较各组治疗后肿瘤重量。将剥除肿瘤置于10％的中性福尔马林中固定24h，用梯度增高的酒精置换出组织内水分，石蜡包埋，并切成4μm厚度的石蜡切片。石蜡切片用二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，苏木素-伊红染色，树胶封片。在光学显微镜下观察移植瘤细胞形态学变化。
　　 4)组织蛋白匀浆后，提取蛋白，BCA蛋白定量检测试剂盒测定蛋白浓度。Western blotting检测空白组、DS组及DS/Cu组Nrf2及P65蛋白表达变化。
　　 8、采用SPSS13.0软件进行统计学分析，两组间均数的比较使用独立样本t检验方法;配对剂量资料的比较采用配对样本t检验;多组间均数比较使用析因分析和单因素方差分析方法进行统计，在方差分析显著的情况下使用Bonferroni(方差齐性)进行多重比较;若方差不齐则采用近似F检验（如Welch方法）代替方差分析后采用Dunnett T3方法进行多重比较;计量资料用x±S表示，检验水准为α=0.05。
　　 结果:
　　 1、DS和DS/Cu对Raji细胞在体外具有明显抑制增殖的作用:
　　 不同浓度的DS作用于Raji细胞72h后结果显示细胞存活率均有不同程度的下降，且呈剂量依赖性，其IC50浓度为(0.793±0.08)μM。上述不同浓度DS分别与浓度1μM Cu2+溶液联合后对Raji细胞增殖抑制作用显著增强，IC50浓度降为(0.085±0.015)μM。DS/Cu对Raji细胞的IC50显著低于DS单药，差异有统计学意义(t=15.110、P=0.000)，提示Cu可显著增强DS对Raji细胞的增殖抑制作用。
　　 2、DS和DS/Cu对Raji细胞具有诱导凋亡作用:
　　 根据MTT和预实验结果，选取24小时IC50浓度的DS(DS:3.3μM)及上述浓度的DS联合Cu(Cu2+:1μM)分别作用Raji细胞6小时、12小时、24小时后观察细胞凋亡比例变化。结果经析因方差分析显示，DS和DS/Cu分别作用于Raji细胞时间主效应差异存在统计学差异(F=6.990，P=0.001)。随作用时间延长，Raji细胞凋亡比例逐渐升高，凋亡比例表现时间依赖性，不同时间点DS及DS/Cu组凋亡细胞比例均高于对照组(P＜0.05)。进一步运用单因素方差分析比较不同处理组细胞凋亡率的差异，不同时间点DS/Cu组凋亡细胞比例均显著高于对照组，差异具有统计学意义(P＜0.05)，24小时DS组凋亡细胞比例高于对照组，差异具有统计学意义(P＜0.05)，12小时和24小时DS/Cu组凋亡细胞比例显著高于DS组，差异具有统计学意义(P＜0.05)。统计结果显示DS和DS/Cu对Raji细胞均存在诱导凋亡的能力，但DS/Cu诱导细胞凋亡的作用明显强于DS。
　　 3、DS和DS/Cu对肿瘤细胞内ROS水平的影响:
　　 选取24小时IC50浓度的DS(DS:3.3μM)及上述浓度的DS联合Cu(Cu2+:1μM)分别作用Raji细胞6小时、12小时、24小时后观察细胞内ROS水平变化。结果经析因方差分析显示，DS和DS/Cu分别作用于Raji细胞时间主效应差异存在统计学差异(F=10.252，P＜0.001)。随作用时间延长，Raji细胞内ROS水平逐渐升高，并呈现时间依赖性，不同时间点的DS或者DS/Cu诱导Raji细胞内ROS蓄积的能力均高于对照组(P＜0.05)。进一步运用单因素方差分析比较不同处理组ROS水平的差异，不同时间点DS和DS/Cu组ROS生成水平均显著高于对照组，差异具有统计学意义(P＜0.05)，12小时和24小时DS/Cu组ROS水平高于DS组，差异具有统计学意义(P＜0.05)。结果表明DS和DS/Cu均能诱导Raji细胞内ROS蓄积，但DS/Cu诱导Raji细胞内ROS蓄积的能力明显强于DS单药。
　　 4、Western blotting检测JNK通路蛋白及P65蛋白表达变化:
　　 共设立空白对照组、Cu单药组、DS单药组及DS/Cu联合组，作用Raji细胞1小时后，western blotting结果显示DS和DS/Cu处理组Raji细胞内磷酸化.JNK(P-JNK)表达水平显著增加，作用6小时后其下游分子C-jun表达水平较其他组显著增加，其中DS/Cu组上调更明显。同样以western blotting检测作用Raji细胞24小时候细胞核内P65蛋白表达变化，DS和DS/Cu组P65蛋白表达均有下调，同样DS/Cu组P65蛋白下调更加明显。
　　 5、Western blotting检测Nrf2蛋白表达变化:
　　 设立空白对照组、Cu单药组、DS单药组及DS/Cu联合组，分别作用Raji细胞6小时、12小时及24小时后，western blotting结果显示作用6小时和12小时后，DS及DS/Cu组细胞核内Nrf2蛋白表达水平较对照组明显增加;但当作用时间延长至24小时，DS及DS/Cu组细胞核内Nrf2蛋白表达水平较对照组反而显著下降，且DS/Cu组Nrf2蛋白表达水平下调更加明显。
　　 6、Western blotting检测加入ROS抑制剂NAC后C-jun、P65及Nrf2蛋白表达变化:
　　 Western blotting结果显示加入ROS抑制剂NAC后DS/Cu组对C-jun蛋白表达上调及P65及Nrf2蛋白表达下调的作用均可以被NAC不同程度的抑制。
　　 7、成功建立Burkitt's淋巴瘤裸鼠移植瘤模型:
　　 移植成瘤率75％。中位成瘤时间6天(5-8天)，各组间差异无统计学意义(P＞0.05)。实验按计划结束前无裸鼠死亡。
　　 8、DS和DS/Cu对Burkitt's淋巴瘤裸鼠移植瘤生长的抑制作用:
　　 接种细胞后第6天、开始干预前移植瘤体积差异无统计学意义(P＞0.05)，荷瘤鼠体重差异也无统计学意义(P＞0.05)。灌胃用药后，DS和DS/Cu组的裸鼠移植瘤的体积和重量均显著低于对照组，差异具有统计学意义(P=0.028和P=0.011;P=0.019和P=0.005)。DS/Cu组的瘤体体积和重量与DS组比较，两组差异无统计学意义(P＞0.05)。移植瘤标本经HE染色后显示，对照组肿瘤细胞及间质均较用药组丰富，实验组部分细胞出现核内致密质块、核碎裂或核固缩，嗜酸性染色增强。提示这些细胞在形态上出现了凋亡的改变，DS/Cu组较明显。
　　 9、Western blotting检测治疗后裸鼠移植瘤组织中Nrf2及P65蛋白表达改变:移植瘤组织提取的蛋白质经Western blotting检测结果显示DS及DS/Cu组P65及Nrf2蛋白表达均下调，其中DS/Cu组下调更加显著。
　　 结论:
　　 1、DS单药对Raji细胞具有抑制增殖及诱导凋亡作用，Cu可显著增强DS抑制Raji细胞增殖及诱导其凋亡的作用。
　　 2、DS和DS/Cu均可促进Raji细胞内ROS生成，DS/Cu作用更加显著，且细胞内ROS增加呈现时间依赖效应。
　　 3、DS单药和DS/Cu能够增加Raji细胞内磷酸化JNK(P-JNK)和c-jun蛋白表达水平，下调NF-κ B通路中P65蛋白表达水平，提示活化JNK/c-Jun通路及抑制NF-κ B通路是DS/Cu杀伤Raji细胞的重要机制之一。
　　 4、12小时内随着DS单药和DS/Cu作用时间延长，细胞保护核转录因子Nrf2蛋白表达水平也增加，与细胞内ROS增多成对应关系。但作用24小时后Nrf2蛋白表达水平反而下调，其中DS/Cu组下调更加显著，而ROS水平继续升高。提示ROS在细胞内的大量蓄积超过阈值，能够抑制Nrf2的活化，促进DS/Cu诱导Raji细胞凋亡的作用。
　　 5、ROS抑制剂NAC能抑制DSF/Cu对C-jun、P65和Nrf2蛋白表达的影响，提示ROS与JNK、NF-κB和Nrf2通路之间的相互作用可能是DS/Cu诱导Raji细胞凋亡的重要机制。
　　 6、DS及DS/Cu可抑制Burkitt's淋巴瘤裸鼠移植瘤生长，DS/Cu抑制作用更加明显，其机制同样与下调P65和Nrf2表达水平有关。