近江牡蛎糖原提取、纯化及化学结构研究

牡蛎（Oyster），俗称蚝、海蛎子、蛎黄，属牡蛎科，双壳类软体动物，是我国重要海洋贝类，其分布广泛，资源丰富。牡蛎肉肥味美，营养丰富，富含蛋白质、糖原、氨基酸、维生素及微量元素。研究表明，牡蛎糖原具有解酒保肝、抗癌等生理活性，但其化学结构尚不清楚。本论文以近江牡蛎为原料，对牡蛎糖原进行提取制备，分离纯化，并对纯化的牡蛎糖原组分进行化学结构分析，为牡蛎糖原构效关系的研究提供理论依据。主要研究的内容及结果如下：
　　1.牡蛎糖原提取工艺优化
　　采用水提法、碱提法和酶提法分别提取牡蛎糖原，试验结果表明，碱提法的提取率最高（90.14％）。对碱提法进行了工艺优化。选择KOH浓度、提取温度、提取时间三个因素分别进行单因素试验。在单因素试验基础上，进行三因素三水平的正交试验，各因素对牡蛎糖原提取率的影响主次顺序为：温度>KOH浓度>时间，对试验组合进行优化，得到最佳提取条件：KOH浓度30%、温度90℃，时间120 min，此时，糖原提取率为92.45%，得率为4.55%。
　　采用Sevag法除蛋白。牡蛎糖原提取液经5次脱蛋白后，蛋白去除率达到91.6%，经紫外扫描，在280nm处无特征吸收峰。综合考虑除蛋白效果和经济性，选择5次作为除蛋白的最佳次数。
　　选用最佳工艺条件提取牡蛎糖原液，经脱色、Sevag法除蛋白、乙醇沉淀、透析和冷冻干燥的方法制得牡蛎糖原粗品OG，其总糖含量为80.72%，蛋白质含量为1.96%，脂肪仅为0.16%。
　　2.牡蛎糖原分离纯化
　　采用DEAE-52纤维素阴离子交换柱层析对牡蛎糖原粗品OG进行分级纯化，依次用蒸馏水，0.1 mol/L、0.2 mol/L、0.3 mol/L、0.4 mol/L和0.5 mol/L的NaCl溶液洗脱，分别得到OG0、OG1、OG2、OG3、OG4和OG5六个糖组分。再利用Sepharose2B凝胶柱层析对得率较高的OG0、OG1和OG2组分进行分离，得到OG0-1、OG1-1和OG2-1三个组分。采用高效凝胶渗透色谱法证明OG0-1、OG1-1和OG2-1三者均为单一的牡蛎多糖组分。
　　3.牡蛎多糖基本理化性质
　　采用苯酚-硫酸法、Folin-酚法分别对 OG0-1、OG1-1、OG2-1中总糖和蛋白质含量进行分析，结果表明，OG0-1、OG1-1和 OG2-1的总糖含量分别为94.45%、97.82%、86.68%；蛋白质含量分别为0.61%、0.55%、1.24%。采用气相色谱法对OG0-1、OG1-1和OG2-1进行构成糖分析，结果显示，OG0-1由鼠李糖和甘露糖组成，其摩尔百分比分别为90.05%和8.71%；OG1-1仅由一种单糖葡萄糖组成；OG2-1由四种单糖组成，鼠李糖、岩藻糖、木糖、半乳糖的摩尔百分比分别为57.47%、4.06%、12.11%、22.56%。以T系列标准葡聚糖作为分子量标准品，采用高效凝胶渗透色谱法测定OG0-1、OG1-1、OG2-1的相对分子质量，结果表明，OG0-1、OG1-1、OG2-1的相对分子质量分别为166万、227万和233万Da。
　　4.牡蛎多糖组分由三个单一的纯化组分组成，OG1-1是糖原。OG0-1和OG2-1可能是以鼠李糖为主链的螺旋藻多糖，这是由于牡蛎进食海藻，在体内蓄积的藻类多糖。
　　5.牡蛎糖原组分OG1-1化学结构分析
　　对牡蛎糖原组分OG1-1进行红外光谱分析，结果显示OG1-1具有多糖类物质的特征吸收。在862 cm-1处出现吡喃糖环α型的C-H变角振动吸收峰，说明存在α型糖苷键。经过核磁共振波谱分析，表明OG1-1存在1,4-糖苷键，并进一步证实OG1-1为α型吡喃糖。经甲基化反应和气质联用分析，结果表明，OG1-1主链由（1,4）-葡萄糖构成，存在1-4,6分支和一些末端糖基（1→）。根据峰面积计算它们的摩尔比，约为1:81:12，主链上约有15%的支链。