P.fluorescens发酵生产胞外多糖的结构分析及活性评价

近年来，多糖作为一种活性物质市场需求量日益增大，细菌胞外多糖是细菌液体发酵代谢产生的，利用细菌代谢产糖具有周期短、产量高、质量稳定的优点，是工业生产多糖的一种高效、节能的方式。不同产糖菌株所需要的生长条件差异很大，经过定向筛选的产糖菌株通过优化培养可以不同程度的提高胞外多糖的产量，这些胞外多糖一般都具有潜在的生物学活性。本论文对实验室前期从啤酒大麦中分离筛选出的一株细菌菌株进行了研究，发现其胞外多糖产量和性状相对稳定。以胞外多糖产生量为指标，对该菌液体发酵产胞外多糖的培养条件进行了优化；采用高效凝胶渗透色谱法、气相色谱法、酶解法、液质联用技术以及核磁共振技术对该胞外多糖的结构进行了分析；在此基础上初步探索了该胞外多糖体外吸湿保湿性能及抗氧化活性。主要研究内容及结果如下：
　　1.对目标菌株进行形态学和分子生物学的鉴定，经形态学特点和16SrDNA鉴定为荧光假单胞菌，命名为Pseudomonas fluorescens PGM37，目前保存于中国典型微生物保藏中心，保藏号为CCTCC NO. M2012183。
　　2.通过单因素和响应面实验相结合的方法，确定了P. fluorescens PGM37发酵产胞外多糖的最适培养条件为：初始pH7.5，摇瓶装液量100mL/250mL，接种量5％，培养温度28℃，摇床转速180rpm；产糖的最佳培养基组成为：蔗糖36.2g/L，酵母膏3.3g/L，NaCl1.1g/L，CaCl20.2g/L。在上述培养基组分和培养条件下发酵36h，所得产量为10.1163g/L。通过测定发酵曲线得到该菌株产糖量在48h时达到最高，为11.37g/L。
　　3.对多糖提取工艺进行优化，选择调节发酵液pH为8，2.5倍乙醇沉淀多糖，用去离子水复溶后再次醇沉，冷冻干燥后得多糖粗品，经过Sephacryl S-300HR柱层析纯化得到分子量均一的多糖纯品，经过高效凝胶渗透色谱法确定胞外多糖分子量为367.6kDa。
　　4.经过气相色谱分析得到该多糖由甘露糖和葡萄糖以1:1的比例构成。红外光谱和一维核磁均显示该糖为β-D-吡喃型且无其他取代基团。利用专一性降解酶水解该胞外多糖，将酶解产物分级醇沉分离后进行ESI-LC-MS分析，同时结合1D NMR和2D NMR以及红外光谱确定其结构重复单元为β-D-Glcp-(1,4)-β-D-Manp-(1,4)-β-D-Glcp-(1,4)-β-D-Manp。
　　5.对P. fluorescens PGM37胞外多糖的体外吸湿保湿和抗氧化活性进行探究，该多糖保湿性能远远优于甘油并仅次于透明质酸，在一定的浓度范围内可以达到水分含量的动态平衡；多糖对·OH、DPPH·自由基的清除、抗以卵黄脂蛋白为底物的脂质过氧化均具有显著的效果，且存在良好的量效关系，随着 EPS浓度的增大，其清除或抑制效果增强，EC50值分别为7.44mg/mL、16.76mg/mL、17.18mg/mL，具有较强的体外抗氧化活性，在化妆品和医药方面有着潜在应用价值。
　　P. fluorescens PGM37胞外多糖和植物魔芋葡甘聚糖（KGM）结构具有很大的相似性，而KGM现已被国内外学者多次证实具有很好的吸湿保湿以及抗氧化、抗肿瘤活性等，探索实验证明该胞外多糖也具有一定的吸湿保湿和抗氧化生物性能。目前未见报道有微生物产此种类的葡甘聚糖，当前的葡甘聚糖仅有魔芋这一单一植物来源。P. fluorescens PGM37产糖培养基成分要求简单、产量稳定、生产成本低，适合工厂的规模化生产，有很大开发前景。本论文的研究为微生物来源的葡甘聚糖的工业化生产、探索结构和活性的关系以及潜在的开发应用提供理论基础。