胃宁颗粒对胃癌前病变E-cadherin、P16、c-myc基因甲基化的相关调控

目的:通过对大鼠胃癌前病变组织中E-cadherin、P16、c-myc基因甲基化的检测，研究胃宁颗粒对胃癌前病变表观遗传修饰作用。
　　 方法:健康Wister大鼠60只，雄性，体重(280±20)g，随机分成正常对照组、模型组、胃宁颗粒治疗组高剂量组、中剂量组、低剂量组。除正常组正常饲养外，其余各组大鼠每日自由饮用180μg/mlN-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)液;每周给予每只大鼠56℃10％盐水1ml灌胃1次;每进食2天禁食1天，进食当天下午每只大鼠用20mmol(0.85％)脱氧胆酸钠溶液灌胃;禁食当天下午每只大鼠用1ml乙醇灌胃;每周用钳子夹住大鼠尾部一次，使之保持激怒、争夺状态，持续10分钟。造模同时治疗组按高、中、低不同剂量给药。连续24周后，经随机病理检测，提示胃癌前病变动物模型复制成功，全部处死。采用甲基化特异性PCR(methylation-specificPCR，MSP)方法检测正常组、模型组、治疗组（高、中、低）中E-cadherin、P16、c-myc基因甲基化状态。
　　 结果:(1)一般情况:在正常组大鼠中，大鼠表现出神态安逸，形体肥胖，被毛光泽且贴身，食量大而稳定，大便颗粒状，尾部色淡红，活动灵敏;在模型组大鼠中，大鼠表现出精神萎靡不振，形体消瘦，被毛蓬松且无光泽，食量少而不定，大便塘烂，尾部色淡白或苍白，懒于活动且反应迟钝;高、中、低剂量组食量和体重均上升，大便成形，活动增加等上述表现均不同程度好转。
　　 (2)病理学变化①肉眼观察:大鼠造模至实验结束时，正常组大鼠胃腔完整，未出现变形，胃壁厚薄适中未见异常，胃粘膜光滑平整;模型组大鼠胃腔已变形，胃壁增厚且伸展性差皱壁平坦，部分大鼠胃粘膜充血，偶有少量的点状出血，部分大鼠胃粘膜粗糙呈灰白色或粘膜黄染;病检的2只模型大鼠，其中1例于十二指肠处出现增生性结节，结节黄豆大小，菜花状，性质硬（组织学检查确诊为早期腺癌），另一例于胃窦部出现溃疡样缺损，绿豆大小，缺损粘膜粗糙潮红伴糜烂（组织学检查确诊为消化性溃疡）;胃宁颗粒高、中、低剂量组大鼠粘膜较光滑呈粉红色，皱壁排列较规则，未见增生性结节及溃疡。②HE(HaematoxylinEosin)染色光学显微镜下观察:胃宁颗粒正常组大鼠胃黏膜见上皮完整，上皮细胞的排列整齐且未见脱落或缺损，固有膜腺体形状规则，以嗜酸性粒细胞浸润为主;模型组大鼠胃黏膜粗糙、糜烂、不完整，镜下可见不同程度的变性或坏死的脱落细胞，主要为淋巴细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和少量单核细胞浸润的炎细胞，腺体不同程度的减少和出现肠上皮化生;高、中、低治疗组大鼠胃黏膜完整，以嗜酸性粒细胞浸润为主，受浸润的炎细胞数量低于其它各组。
　　 (3)透射电镜观察结果:在正常组中大鼠胃黏膜上皮细胞的排列较为规则且紧密，腺腔排列规则整齐，腺体丰富，各类细胞内的细胞器较丰富;模型组大鼠胃黏膜上皮细胞的间隙出现增大，粘液细胞核可见畸形、固缩，各类细胞器均减少、变形，腺腔内微绒毛消失可见肠型微绒毛;经胃宁颗粒干预治疗后，高、中、低组大鼠胃粘膜中各类细胞器数量较模型组增多，腺腔内短微绒毛增多，而肠型微绒毛则减少或消失。(4)造模24周后，模型组大鼠病理诊断出现肠化生、不典型增生等病理改变。E-cadherin基因x2值18.720，P=0.001＜0.01;P16基因x2值23.180，P=0.000＜0.01;c-myc基因x2值13.486，P=0.009＜0.01有统计学意义。用bonferroni法调整检验水准做高中低各组两两比较，α=0.0125。模型组与正常组比较，E-cadherin基因x2值18.237，P=0.000＜0.0125;P16基因x2值18.237，P=0.000＜0.0125;c-myc基因x2值13.486，P=0.009＜0.01证明造模成功。(5)高、中、低治疗组大鼠病理诊断呈不同程度糜烂但较模型组轻。用bonferroni法调整检验水准做高中低各组两两比较，α=0.0125。E-cadherin基因各治疗组与模型组比较P＞0.0125无统计学差异;各治疗组之间P＞0.0125无统计学差异。P16基因高剂量组与模型组比较P＞0.0125无统计学差异;中、低治疗组与模型组比较P＜0.0125有统计学意义。c-myc基因高、低剂量组与模型组比较P＞0.0125无统计学差异;中剂量组与模型组比较，x2值9.036P=0.005＜0.0125有统计学意义。
　　 结论:(1)模型的制作成功并且较为理想:本实验选用雄性大鼠，采用以MNNG液为主诱导癌变，通过模拟成食、烫热（15％热盐水）、模拟胆汁返流（0.85％脱氧胆酸钠）、模拟酒精等刺激（40％酒精）等因素的加以运用，并结合一些中医病因中诸如饥饱失常、夹尾等导致精神情志失调的多因素联合攻击的方法，成功将胃癌前病变的大鼠模型复制成功，使人类胃癌前病变的病理改变特征得以呈现。最后，模型组大鼠没有一例恢复正常，因此本实验制造的大鼠模型具有稳定性强重复性好成功率高，不仅能够模拟可能引起人的致病因素，又结合了中医病因，而且有效的缩短了造模的时间，是一种较为理想的胃癌前病变模型的制造方法。
　　 (2)胃宁颗粒对胃癌前病变表观遗传修饰作用:胃宁颗粒对E-cadherin基因甲基化无相关作用;对p16、c-myc基因甲基化发生相关调控作用。
　　 (3)体现了中医药优越性:胃癌前病变属祖国医学的“痞症”范畴，病因病机较复杂，但其基本病理病机的改变即肝脾（胃）不调，从而变生为气机升降出入失调、气滞血瘀、寒热虚实错杂等病理情况。治疗上宜调和肝脾（胃）、行气活血、兼调寒热。胃宁颗粒以益气健脾，活血化瘀抗癌，既能增强机体免疫力，又可扶正去邪去除病因，在改善胃癌前病变模型大鼠的一般情况、炎症、胃粘膜萎缩及对E-cadherin、P16、c-myc基因甲基化的相关调控上，体现了中医药的整体调理，能够进行多基因、多靶点、多层次、多途径调控的优越性。