高效纤维素分解菌Aspergillus fumigatus Z5的产酶研究与胞外蛋白组学分析

当前世界能源、资源以及环境问题日趋严重，人类经过长期的研究希望利用纤维素酶将地球上最丰富、最廉价的植物纤维转化为能被人类使用的能源和资源。随着纤维素酶需求量的增加，高效的纤维素分解菌以及纤维素酶的获得已经成为世界各国微生物界研究的热点，特别是在堆肥和生物能源领域的研究。纤维素的分解是堆肥过程或纤维素工业利用中最重要的步骤之一，其过程主要由微生物分泌的纤维素酶来完成。纤维素酶是指能够水解纤维素及其衍生物的一系列酶的总称，主要包括内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶，它们相互协作来分解纤维素。
　　 采用结晶纤维素唯一碳源法从不同的堆肥样品中分离筛选到了一株高效的纤维素分解真菌Z5，结合菌株形态特征和ITS序列分析将其鉴定为烟曲霉（Aspergillusfumigatus Z5）。利用不同的底物在固体发酵条件下诱导菌株产酶，通过测定纤维素酶活力来评价菌株Z5纤维素分解能力。在固体发酵下优化了菌株Z5的产酶条件，结果表明菌株的最佳产酶条件为50℃培养、80％起始含水率、起始pH4.0以及7％的接种量，在该条件下内切葡聚糖酶活力和滤纸酶活力分别为526.3和144.6 U·g-1干重，该结果比已报道同属的大部分菌株的活力都要高。菌株分泌的粗酶的最佳催化温度和最佳催化pH分别为50℃和pH5.0;粗酶的热稳定性和pH稳定性研究结果表明，在70℃条件下保持20h后，其相对酶活力为37.8％，在pH5.0的缓冲体系中，粗酶的相对酶活力保持在95％以上的水平。菌株Z5分泌的粗酶的酶谱分析结果表明，在含有羧甲基纤维素的丙烯酰胺胶里面能够检测到8条明显有内切葡聚糖酶活力的条带。将菌株Z5分泌的粗酶对玉米芯进行糖化实验并利用酿酒酵母进行产生物酒精实验，结果表明生物酒精的产量比较可观，达到0.112 g·g-1干重(gDS)。
　　 分别以葡萄糖、结晶纤维以及稻草粉为唯一碳源诱导菌株Z5进行液体产酶，并测定了纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶的活力。结果表明，以稻草秸秆粉为唯一碳源诱导条件下，内切葡聚糖酶活力第四天达到最大值(12.17 U·ml-1)、滤纸酶活力第五天达到最大值(1.71 U·ml-1);外切葡聚糖酶活力不断的升高，并在结束培养时达到最大值(0.58 U·ml-1);β-葡萄糖苷酶酶活力第四天达到了最大值(2.49 U·m1-1)、木聚糖酶活力二天后达到最大值(181.87 U·ml-1)、海带多糖酶活力两天后达到最大值(2.37U·ml-1)、地衣多糖酶活力三天后达到最大值(12.78 U·ml-1);利用iTRAQ技术鉴定并定量出了54个蛋白，根据其功能的不同将其分成了不同的类型，其中纤维素酶占21％、半纤维素酶占8％、糖苷水解酶占11％、几丁质酶占5％、木质素酶类占2％、磷酸酯酶占3％、转运蛋白占3％，蛋白酶占5％、淀粉酶占2％、脂肪酶占2％、果胶酶占2％、氧化还原酶占6％，域蛋白占3％、其他类占13％、而未知蛋白占了14％。这些鉴定的蛋白的理论分子量分布在180-10kDa之间，但是大部分蛋白的分子量主要聚集在80-20kDa;鉴定蛋白的预测等电点分布在4.5-9.5之间，而pI4.5-6.5之间的蛋白数量居多。
　　 通过简并引物并结合hiTail-PCR的方法从菌株Z5中克隆到了两个纤维素酶基因agl2和egl3，并在毕赤酵母X33中成功表达。两个基因预测的氨基酸序列分析结果表明，两个基因都和糖基水解酶第五家族的酶有很高的相似性。SDS-PAGE和WesternBlot分析结果表明，两个基因都已经获得了功能表达，而酶谱分析结果显示两个重组内切葡聚糖酶Egl2和Egl3都有内切葡聚糖酶活力。两个重组内切葡聚糖酶的酶学特性研究表明，Egl2的最佳pH条件为5.0，而Egl3的最佳pH为4.0; Egl2的最佳催化温度为50℃，而Egl3的最佳催化温度为60℃;两个内切葡聚糖酶都具有良好的热稳定性，在40-60℃的温度范围和pH4-7范围内都能够保持较高的相对酶活力。分别在Egl2和Egl3的最佳催化条件下，以羧甲基纤维素为底物测定了两个重组酶的Km和Vmax值，结果表明Egl3的催化效率要高于Egl2。通过薄层层析的方法分析了两个重组酶对不同纤维二糖的水解效率，结果表明，Egl2可以催化分解纤维四糖和五糖而不能催化分解纤维二糖和三糖，而Egl3除了纤维二糖外都可以催化分解。
　　 利用离子交换层析、分子筛和亲和层析的方法，从菌株Z5分泌的粗酶液中分离到了一个电泳纯的β-葡萄糖苷酶nBgl3。利用LC-MS/MS的方法检测了nBgl3的内部氨基酸序列，通过NCBI的比对分析获得了比较保守的氨基酸序列，在此基础上通过PCR方法获得了编码该酶的基因。基因的碱基序列分析表明，bgl3包含了一个2622bp的完整阅读框，该基因编码的蛋白的预测分子量为91.47kDa; bgl3预测的氨基酸序列的比对分析表明该基因是糖基水解酶第三家族成员。通过构建酵母表达载体，将bgl3在毕赤酵母X33中成功表达，并获得了一个重组β-葡萄糖苷酶rBgl3;活性胶电泳分析结果表明rBgl3具有β-葡萄糖苷酶活力，能够在含有pNPG的活性胶内检测到荧光条带。两个重组纯化的β-葡萄糖苷酶酶学特性分析结果表明，nBgl3和rBgl3在60℃和pH6的条件下都具有最佳的催化效率，而在50-70℃和pH4-7的范围内两个β-葡萄糖苷酶都有较好的稳定性。本研究分析了两个β-葡萄糖苷酶的nBgl3和rBgl3不同底物的比酶活力，结果表明两个酶对底物pNPG有最大的比酶活力，分别为103.5和101.7U·mg-1，但是两个酶对羧甲基纤维素、乳糖、木聚糖几乎没有催化活力。
　　 综上，本论文利用结晶纤维素唯一碳源法，从堆肥高温层样品中分离筛选到了一株高效的纤维素分解真菌A.fumigatus Z5，通过单因子和正交试验获得了该菌株的最佳产酶条件，同时还研究了A.fumigatus Z5菌株分泌的粗酶特性，为该菌株应用前景的研究具有重要意义;利用蛋白组学研究方法（双向电泳和iTRAQ），系统分析了菌株Z5在不同碳源诱导条件下胞外酶系分泌情况，揭示了菌株Z5在木质纤维素分解过程的代谢途径，同时为真菌Z5的信号转导、基因表达调控等方面研究提供了理论依据。