禾谷镰刀菌PTC1基因敲除及功能初探

禾谷镰刀菌(Fusariumgramminearum)是引起小麦赤霉病的首要致病因子，是小麦第二大真菌性病害，由该病原菌侵染引起的产量损失和真菌毒素污染严重影响小麦产量和品质，危害食品、饲料的安全，因而在农业生产上具有重要意义。自从1990年代以来，我国和世界其他小麦主要生产国的小麦赤霉病爆发频次都在增加，病害规模不断扩大。多菌灵等化学杀菌剂的广泛使用，已使我国部分小麦主产区的病菌产生一定抗药性，化学杀菌剂的继续大量使用，将有可能增加小麦赤霉病的爆发风险。目前，对禾谷镰刀菌的研究热点逐渐集中在弄清其致病机理和发现新的药物作用靶点。 对禾谷镰刀菌中的功能基因研究，正处在起步阶段。本研究以禾谷镰刀菌中重要信号转导途径的关键调控基因为研究切入点，目的在于初步揭示调控基因的分子，细胞和生物学功能，从而了解重要信号转导途径在调控该菌的生长、发育、与寄主的侵染识别、致病性等方面的作用。在真核细胞模型菌酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中，PTC1基因编码的蛋白是一种2C型丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酯酶，通过对有丝分裂原激活的蛋白激酶Hog1p的去磷酸作用，抑制HOG(高渗透压甘油)途径，是HOG-MAPK途径的负调节因子，而HOG途径与菌丝的形成有密切关系。本研究采用正向遗传学方法研究禾谷镰刀菌FgPTC1基因的功能。我们从禾谷镰刀菌的基因组数据库中搜寻到酿酒酵母ScPTC1同源的基因FgPTC1，基因FgPTC1中含有一个内含子，其ORF(OpenReadingframe)长为1743bp。通过在体外构建基因敲除盒，转化禾谷镰刀菌原生质体，基因敲除盒DNA在体内与目的基因发生同源重组，从而敲除目的基因的敲除策略，将FgPTC1基因的ORF用抗药遗传标记基因替换掉，从而使转化菌株显示特定抗药性。结果我们获得1株FgPTC1基因的禾谷镰刀菌缺失株。以该FgPTC1基因缺失株为研究对象，禾谷镰刀菌野生型PH-1菌株为对照，在平板上设计各种实验方案，进行了表型筛选实验，发现缺失菌株对氯化锂的敏感性增加，在低温下菌落生长速度明显减慢，并且在室内致病力试验中表现出与野生型致病性的差异。 本研究还运用比较基因组学方法，探索了FgPTC1基因在模式真菌酿酒酵母中的互补功能。为此，我们提取野生型禾谷镰刀菌菌株PH-1的总RNA，通过反转录(ReverseTranscription)的方法，在体外获得PH-1菌株的总cDNA。以此cDNA为模扳，在FgPTC1基因ORF两端设计特定引物，PCR获得FgPTC1基因不含有内含子的ORF克隆，并将其亚克隆到带有强启动子ADH的酵母表达质粒上，转化酵母ScPTC1基因的缺失菌株，对目的转化子进行平板表型实验。结果我们发现FgPTC1基因可以互补酿酒酵母ScPTC1基因在氯化锂抗性方面的功能，表明FgPTC1基因和酿酒酵母ScPTC1基因是同功基因。本工作为进一步研究FgPTC1基因调控禾谷镰刀菌生长，发育和致病性奠定了基础。