微拟球藻PUFAs相关合成酶基因功能研究与转基因体系的建立

多不饱和脂肪酸(Polyunsaturatcd fatty acids,PUFAs)对维持动植物的生理功能和人类健康至关重要,尤其是是EPA(Eicosapentaenoic acid,20∶5n3)和DHA(Docosapemaenoic acid,22∶6n3)。海洋微藻是海洋食物链的初级生产者,许多物种具有从头合成PUFAs的能力且含量较高,其脂肪酸具有组成稳定,不含胆固醇,没有难闻的鱼腥味和重金属污染等优点,正逐步成为PUFAs的一个重要来源。
　　 微拟球藻(Nannochloropsis oculata(Droop)D.J.Hibbered)是一种海洋真核单胞经济微藻,富含的EPA且含量可达到总脂肪酸的30％以上。推测在该藻中存在高效合成PUFAs的酶系,有望得到具有较高酶活性的PUFAs合成相关的酶基因资源。本研究克隆得到PUFAs合成途径中的两个合成酶基因—△6-去饱和酶和C20-延伸酶基因,并在酿酒酵母真核表达系统中进行了初步的功能验证,分析了不同培养温度下藻细胞中PUFAs的含量与合成酶基因转录水平、酶活性之间的关系。同时进行了微拟球藻的转基因体系构建的研究工作,以期在本体内验证酶基因的功能。论文的具体研究内容如下:
　　 一.分析微拟球藻cDNA文库,发现了一段△6-去饱和酶基因3'端序列,结合5'RACE的方法得到了该基因得全长序列。分析发现:该基因的ORF包括1425个碱基,编码474个氨基酸残基;编码的蛋白序列N端具有Cyt-b5结构,C端具有3个保守的组氨酸簇(分别为HDFLHH、HNTHH、QVDHHLP),符合前端去饱和酶典型特征。在NCBI中进行过.BlastX比对发现,该基因编码的蛋白与三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)、海链藻(Thalassiosira pseudonan)、小立碗藓(Physcomitrella patenssubsp)和高山被孢霉(Mortierella alpine)等物种的△6-去饱和酶具有很高的序列相似性。将该基因(命名为Nanoc-D6)连接到表达质粒pYES2,转入酿酒酵母(Saccharomy cerevisiae)INVScl诱导表达进行功能的初步验证。实验结果显示,该基因编码的蛋白既能催化Linoleic Acid(18:2△9,12)生成γ-Linolenic Acid(18:3△6,9,12),又能催化α-Linolenic Acid(18:3△9,12,15)生成Stearidnoic Acid(18:4△6,9,12,15),还可以同时催化等量两种底物分别生成相应的产物。因此,推测该基因编码的蛋白具有△6-去饱和酶的功能,可同时参与n3和n6途径中的去饱和反应。
　　 二.简并PCR和RACE技术相结合克隆到一个延伸酶的cDNA全长序列。该基因ORF为966个碱基,编码321个氨基酸残基;靠近N段有一段HWYHH的序列已证实为延伸酶的酶活性中心;推测该蛋白中有5个过膜区域,分别位于aa65～90、aua101～126、aa148～170、aa235～260和aa273～295氨基酸残基之间,推测该延伸酶可能是属于PUFAs Elongase/ELO类。同样在酿酒酵母INVSc1真核表达系统中进行功能验证发现该基因编码的蛋白只能延伸EPA(20:5△5,8,11,14,17)生成产物Docosapentenoic acid(22:5△7,10,13,16,19)。
　　 三.温度影响细胞生长和PUFAs的相对含量。在10℃～30℃范围内,同一接种密度(1.5×106 cells/mL)的藻细胞在培养温度为25℃时生长最快,指数生长初期的细胞密度最高(3×10-7 cells/mL)。不同培养温度下的藻细胞中PUAs的种类和含量亦不相同。随培养温度的升高,可检测到的脂肪酸种类减少。培养温度20℃的藻细胞中EPA和PUFAs含量最高,分别为36.59％和43.96％,且△6-去饱和酶转化率也是最高,为39.31％。RT-PCR结果显示△6-去饱和酶基因的转录水平在5个不同培养温度下的藻细胞中差异显著,最高转录水平出现在15℃培养的藻细胞中(Ct值为21.45)。实验只检测到了延伸酶基因最高的转录水平出现在20℃培养的藻细胞中(Ct值为21.418),未能检测到该酶作用的底物和产物。结果证明,PUFAs含量最高的培养温度要比最适生长的培养温度低;转录水平最高的培养温度要比酶活性最高培养温度偏低;转录水平并不能代表酶活性的高低。
　　 四.微拟球藻转基因体系构建包括敏感抗生素的筛选,原生质体的制备,表达质粒的选择,转基因藻株的筛选与鉴定4部分工作。从5种抗生素(新霉素、链霉素、潮霉素、博来霉素和壮观霉素)中筛选到该藻敏感的抗生素—博来霉素,液体培养基敏感浓度为1μg/mL,固体培养基敏感浓度为0.5μg/mL。终浓度为4％半纤维素酶和2％崩溃酶的酶混合液处理细胞密度为2×107 cells/mL的藻细胞1h,原生质体的制备率最高,并可再生。获得带有博来霉素抗性的基因(Ble,来源于Streptomyces verticillus)和可用于该藻的双启动子Hsp70A-RBSC2(来源于Chlamydomonas reinhardtii)的重组表达质粒pMS188。将该质粒进行线性化处理后,通过电转化(1000V,15μs)的方法转入微拟球藻中。通过含有博来霉素的0.5μg/mL的固体平板和1μg/mL的液体培养基进行筛选转化株,并连续培养6个月,传代5次并进行了PCR检测和Southern blot检测。实验结果证明博来霉素抗性基因在微拟球藻中只有一个整合位点,在压力选择下能够稳定遗传和表达。