酿酒酵母核小体定位理论模型的体外实验研究

核小体作为真核生物中染色质结构的基本构成单位,在基因组上的动态定位能够影响真核生物的基因表达调控。研究表明,DNA序列因素是影响核小体定位的主要因素,体内也受到染色质重塑、DNA甲基化、组蛋白变体与组蛋白修饰、RNA可变剪接等表观因素的影响。
　　基于特定的理论模型来预测模式生物核小体定位,是研究真核生物基因组中核小体定位特征与其调控基因表达作用的重要手段。核小体在真核生物基因组中的非均匀分布与动态定位,与基因的表达调控密切相关。本文根据我们课题组前期构建的基于位置权重矩阵计算核小体定位的理论模型,以1bp为步长,147bp为窗口,分别选取了酿酒酵母1、3、14号染色体上定位较为典型的核小体定位能力强、中、弱各3条147bp序列,采用体外实验的方法验证该理论模型在预测酵母基因组核小体定位的有效性。具体研究内容如下:
　　1.克隆了9条目的DNA序列。利用珠磨法提取酵母基因组作为模板,根据计算的DNA序列在基因组上的位点设计PCR扩增引物,将目的序列扩增,双酶切后插入到载体的多克隆位点,构建重组质粒。利用标记biotin和Cy3荧光分子的引物,大量扩增并回收了9条目的序列,用于核小体组装实验。
　　2.表达纯化了组蛋白H2A、H2B、H3和H4,复性并装配形成组蛋白八聚体。表达纯化后的组蛋白经电泳检测,蛋白条带位置正确,纯度高。用牛血清清蛋白绘制了蛋白标准曲线,相关系数为0.9824,测定了组蛋白的浓度,用于核小体组装实验。
　　3.Biotin标记检测了目的序列对组蛋白八聚体的亲和性。用盐透析法体外组装核小体结构,经过生物素标记检测及量化,计算每条序列形成核小体的吉布斯自由能,分析它们与组蛋白八聚体的亲和力。结果表明,9条序列中有5条序列与理论预测结果完全一致,有4条不完全一致,但总体规律符合理论预测结果;对酿酒酵母1、3、14号染色体上各3条理论设计形成核小体能力强、中、弱序列分别求得反应过程中的表观平衡常数Keq的平均值。结果表明,9条序列实验结果所呈现出来的规律性,与理论预测结果基本保持一致。
　　4.按照9条目的序列相同摩尔比,经过Cy3标记检测实验,发现有7条序列与理论预测结果完全一致。
　　5.采用组蛋白变体H2A.Z与DNA序列体外组装核小体。在H2A.Z与DNA质量比为0.8的条件下,有6条序列对H2A.Z八聚体的亲和性与常规组蛋白的理论计算结果相似;在质量比为1.0的条件下,有7条序列与常规组蛋白相似。但是在H2A.Z组蛋白八聚体体外组装实验中,各条序列均存在明显的核小体滑动现象。